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摘要：本文采用中性蛋白酶和flavourzyme分别水解脱脂小麦胚芽制取小麦胚芽水解物，研究两种不同酶对麦胚蛋白水解速率的影响，同时通过测定水解物清除DPPH自由基的能力和还原能力研究麦胚蛋白水解物的抗氧化性。结果表明，中性蛋白酶对麦胚蛋白的水解速率明显高于flavourzyme；两种酶的水解产物均具有清除DPPH自由 基活性和还原能力。
关键词：小麦胚芽蛋白酶水解DPPH自由基还原能力
中图分类号：TS 201.2，TS 210.9文献标识码：A文章编号：1674-5280（2009）05-0044-04
衰老、癌症及心血管等疾病被公认为与氧化应激损伤及自由基代谢失调相关[1]，因此适当摄入具有抗氧化性的物质可以抑制氧化的进行，帮助机体抵御疾病。目前市场上的抗氧化剂大多为人工合成的抗氧化剂，作用效果好，但化学合成物质存在着安全隐患，因而筛选具有抗氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。
研究表明，多种动植物蛋白及其水解物具有抗氧化功能，包括大豆蛋白[2]、菜籽蛋白[3]、米糠蛋白[4]和鱼蛋白[5]等。
小麦胚芽营养丰富，其蛋白质含量高达30%左右。麦胚蛋白是一种完全蛋白，含有人体必需的8种氨基酸，是一种天然的优质蛋白营养强化剂。麦胚蛋白质中必需氨基酸的比值与FAO/WHO颁布的模式值基本接近，明显优于大米、面粉等谷物蛋白质中必需氨基酸的构成比例。
国内外对麦胚蛋白及其水解物的研究主要集中于功能性质[6-8]，对生理活性研究较少。Zhu等人的研究表明[9]，碱性蛋白酶水解麦胚蛋白制得的水解物具有抗氧化活性。本文采用中性蛋白酶及Flavourzyme两种不同酶分别对小麦胚芽进行水解，并通过测定水解物清除DPPH自由基活性及还原能力研究其抗氧化活性。
1·材料与方法
1.1材料
小麦胚芽，青岛赛麦隆食品有限公司；中性蛋白酶（15万U/g），湖南尤特尔生化有限公司；
Flavourzyme 1000L（1000LAPU/g），诺维信公司。
1.2试剂及仪器
1.2.1试剂
正己烷，氢氧化钠，盐酸，三氯乙酸，铁氰化钾，磷酸，柠檬酸，硼酸等，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产。
1.2.2仪器
LXJ-Ⅱ离心沉淀机：上海医用仪器厂；PHS-3精密pH计：上海雷磁仪器厂；HH-20数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；SHA-C恒温振荡器：常州国华电器有限公司；旋涡混合仪：上海沪西分析仪器厂；752紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司。
1.3实验方法
1.3.1小麦胚芽脱脂
将小麦胚芽用其5倍量的正己烷浸提24 h，抽滤除去正己烷提取液，室温放置除去溶剂得到脱脂小麦胚芽，过80目筛后备用。
1.3.2脱脂小麦胚芽的酶水解
将脱脂小麦胚芽和水加入到反应容器中，置于水浴加热至50℃，用4 N NaOH调节pH至7.0，再加入相应蛋白酶于搅拌下水解，两种酶的水解参数均为：基质浓度5％（w/v），酶与基质比3％，pH 7.0,反应温度50℃。反应过程中加入4 mol/L的NaOH维持pH值恒定。反应120 min后冷却，将水解物在4℃，以4000×g离心20 min除去不溶物,收集上层清液立即加热至85℃维持10min灭酶。冷冻干燥上层清液即得小麦胚芽水解物。
1.3.3水解度的测定方法
蛋白质的水解度（DH）是指蛋白质中的肽键被水解的百分数，其计算公式为：
DH%=（h/htot）×100，
式中h是每克蛋白中被水解的肽键的毫摩尔数，htot则是指每克原料蛋白中肽键的毫摩尔数。本实验采用pH-stat法测定水解过程中的水解度（DH）[10]，即根据水解过程中为保持反应液pH值不变而加入的NaOH的量按下式计算水解度：
式中B为维持pH不变而加入的NaOH体积（m）l，Nb为NaOH浓度，Mp为蛋白质的量（g），α为水解时α-NH2的平均离解度。
1.3.4清除DPPH自由基能力的测定[11]分别移取2.0 ml小麦胚芽水解物溶液和1.3×10-4 mol/L的DPPH甲醇溶液2.0 ml于具塞试管内，摇匀，室温避光反应60 min后于517 nm测定吸光度Ai，同时测定2.0 ml的1.3×10-4mol/L DPPH甲醇溶液和2.0 ml蒸馏水混合后的吸光度A0，以及2.0 ml麦胚芽水解物和2.0 ml甲醇混合后的吸光度Aj，按下式计算小麦胚芽水解物对DPPH自由基的清除率：
1.3.5还原能力测定方法
按照Oyaizu的方法测定还原能力[12]。将小麦胚芽水解物溶解在0.2 mol/L，pH6.6的磷酸缓冲液中,取样品液2.5ml加入试管，加入2.5ml1%（w/v）铁氰化钾溶液，混合物于50℃水浴保温20 min后，快速冷却，再加入2.5 ml的10％三氯乙酸溶液，混匀，以1500×g离心10 min，移取上清液2.5 ml于试管中依次加入2.5 ml蒸馏水、0.5 ml的0.1%FeCl3溶液，充分混匀，室温静置10 min后，测定700 nm处吸光度。吸光度越大表示还原能力越强。
2·结果与讨论 2.1两种蛋白酶水解脱脂小麦胚芽
两种蛋白酶水解脱脂小麦胚芽的水解曲线见图1。从图1明显可知，添加相同量的酶水解，中性蛋白酶对麦胚蛋白的水解速率明显大于Flavourzyme。中性蛋白酶是一种内切酶，它可以从肽链内部切断其专一的肽键进行水解，而Flavourzyme是同时具有外切酶和内切酶活性的复合酶，外切酶从肽链的一端逐步切断相应肽键进行水解，一般说来，内切酶的水解速率较外切酶快，这可能也是本实验中性蛋白酶对麦胚蛋白的水解速率大于Flavourzyme的原因。
由图1可见，在反应的前20 min，中性蛋白酶的水解速率较快，但随着水解的进行，其水解速率逐渐减慢，至60 min左右时水解度曲线趋于平缓。这是因为中性蛋白酶是内切酶，在反应初期，大量的肽键可同时被其水解，但随着水解时间的推移，水解液中可被蛋白酶水解的肽键的浓度逐渐减少，同时酶活性也会随水解进程而逐渐减弱，加之酶本身也是蛋白质，也有被水解的可能。Flavourzyme水解曲线在2 h水解过程中上升趋势较平缓，显然这与它所含外切酶有关。
表1显示两种酶分别水解2 h得到的脱脂小麦胚芽水解物的颜色及蛋白提取率，其中中性蛋白酶水解麦胚蛋白的蛋白提取率明显比Flavourzyme的高。麦胚蛋白的溶解度与蛋白水解度有关，随着水解度的增大，水解物的分子减小，其在水中的溶解度也相应增加。从图1可知，本实验中性蛋白酶水解麦胚蛋白2h的水解度为18%，而Flavourzyme仅为4%，使得前者水解物的溶解度和蛋白提取率相应提高了。中性蛋白酶与Flavourzyme水解物的颜色均为黄色，但深浅略有差异，可能与杂质的不同变化有关。
2.2脱脂小麦胚芽水解物清除DPPH自由基能力
2，2-二苯基-1-苦肼基自由基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）是一种广泛使用的稳定自由基，其甲醇溶液呈紫色，并在517nm处有一个特征吸收峰，当存在自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对，其颜色变为黄色，517 nm处的吸光值减小，所以通过测定吸光度的减少可评价样品清除DPPH自由基能力，此法简便，灵敏且重现性好，常用于评价各种合成或天然样品的抗氧化性。
图2为两种酶各自水解麦胚蛋白2 h的水解物对DPPH自由基的清除率。由图2可知，两种酶水解物均具有相似的清除DPPH自由基能力，且在一定浓度范围内（0~1.5 mg/mL），清除率随着浓度的增加而明显增大。蛋白水解物的抗氧化活性与水解产生的肽和氨基酸的组成、大小和数量有关，即酶的种类和水解度都会影响水解物结构组成和抗氧化活性。
由图3可知，VC清除DPPH自由基的活性大于本实验制取的麦胚蛋白水解物，达到相同DPPH自由基清除率所需的VC的浓度明显低于麦胚蛋白水解物。但小麦胚芽水解物是一种营养丰富的天然物质，可以增加食品中的添加量提高抗氧化活性，它不仅没有副作用还能改善食品的功能性质。
2.3脱脂小麦胚芽水解物的还原能力
本文使用Oyaizu的方法通过测定样品将Fe3+还原成Fe2+的能力评价水解物的还原能力。
由图4可知，脱脂小麦胚芽两种酶水解物的还原能力均随着浓度的增加而增强，且与浓度几乎成线性；两种酶的水解物的还原能力差别不大，Flavourzyme水解物略大于中性蛋白酶水解物，该结果与两种水解物清除DPPH自由基活性测定结果相似。
图5显示VC的还原能力与浓度基本呈线性关系，其还原能力也明显高于脱脂小麦胚芽水解物的还原能力。水解物的还原能力是其提供氢原子或电子的能力，氢原子或电子能够与DPPH自由基作用生成稳定化合物，从这一点上讲，两种测定方法的结果有相似性是可能的。采用不同的测定方法有助于全面地评价天然产物的抗氧化活性。
3·结论
本实验分别使用Flvourzyme和中性蛋白酶水解脱脂小麦胚芽，当蛋白酶用量相同时，中性蛋白酶水解速率较快，麦胚蛋白提取率较高。两种酶的水解物都显示出相似的清除DPPH自由基活性及还原能力。